Blood RNA Kit采用胍鹽與硅膠柱結合法，能夠快速有效地從血液中提取高質量的RNA。血液加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，收集白細胞，在RNA抑制酶環境下裂解白細胞，使RNA釋放出來后可以穩定的吸附在離心柱上，經過四步快速洗滌去除各種鹽分和雜質，最后將RNA溶解于DEPC水中從離心柱上洗脫下來。

試劑盒組成

儲存和穩定性

TRNsol 4℃放置，其他試劑室溫保存。試劑盒從購買之日起1年內有效。

預防RNase 污染，應注意以下幾方面：

? 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。

? 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

? RNA 在Buffer PR中時不會被RNase 降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在1500C烘烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

? 配制溶液應使用RNase-free ddH2O。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC 至終濃度0.1%( v/v)，混勻后放置過夜，高壓滅菌）。

溶液的稀釋準備：

?使用前Buffer WB和RNA Wash Buffer要加入無水乙醇，加入的體積參照產品標簽的提示。

?Buffer R1（10X）需按1:9稀釋。

操作步驟

1.紅細胞裂解液稀釋：根據處理的血液樣品的體積吸取適量的Buffer RL(10X) ，用滅菌水按1:9稀釋。（例如處理單個200μl的血液樣品，吸取140μl Buffer RL，加入1260μl 滅菌水）。

2.在15mL離心管中加入小于1.5mL全血加入5體積的buffer RL工作液（buffer RL經過稀釋）

3.冰上放置 10-15 分鐘，其間顛倒混勻兩次。

注意：在放置過程中，血液會從霧狀變成透亮的溶液。透亮的溶液就表明了紅細胞已裂解。如必要的話，可延長至 20 分鐘。

4.4℃，2100rpm(~400×g離心10分鐘，小心完全吸棄上清液。

5. 立即渦旋20秒，打散白細胞沉淀。向沉淀中加入1ml TRNsol,劇烈渦旋重懸細胞，轉移裂解液至1.5ml離心管中，室溫放置2-5min。

6. 加入0.2ml氯仿。蓋上離心管蓋子，劇烈地振蕩15sec,在冰上孵育5min。室溫下，12,000xg下離心10min。
此時混合物分成三層：底層為苯酚氯仿相層，中間層，和上層水相層。RNA完全存在于水相中。

7. 轉移不多于80%上層水相至新的離心管中，緩慢加入0.7倍體積的無水乙醇，混勻。

8. 將得到溶液和沉淀一起轉入吸附柱中，12,000rpm(~13,400×g)離心30秒。
若一次不能將全部溶液和混合物加入吸附柱，請分兩次轉入GBC吸附柱中，12,000rpm(~13,400×g)離心30秒，棄掉收集管中的廢液。

9.向吸附柱中加入500ul Buffer WB(第一次使用前務必添加乙醇）高心30秒，棄廢液。

10.向吸附柱 中加入600ul RNA Wash Buffer,12,000rpm(~13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。
注意：RNA Wash Buffer使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）

11. 向吸附柱 中加入600ul RNA Wash Buffer,12,000 rpm(-13,400xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

12. 12,000rpm(~13,400×g)離心1分鐘，倒掉廢液，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的實驗

13. 將吸附柱轉入一個新的離心管中，加30-100ul RNase-free Water,室溫放置2分鐘，12,000rpm(~13,400×g)離心1分鐘。
注意：洗脫緩沖液體積不應少于30ul,體積過小影響回收效率。且RNA應保存在-70℃，以防降解。如果想提高RNA得率，可重復上步操作一次，合并兩次得到的溶液。