適用范圍：適用于快速提取各種細(xì)胞組織miRNA和其它各種小RNA

試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

本試劑盒按照指示儲(chǔ)存6個(gè)月不影響使用效果。

儲(chǔ)存事項(xiàng)：

1. Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入無水乙醇后，可以在常溫保存一個(gè)月，如果要更長(zhǎng)時(shí)間保存，請(qǐng)存放在4°C，但是使用前，應(yīng)該先回復(fù)到室溫。

2. Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用幾天后出現(xiàn)沉淀晶體，并不影響使用，直接不吸晶體，吸上清使用就可以。

3. 運(yùn)輸在常溫下進(jìn)行，不影響使用效果。

4. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

產(chǎn)品介紹：

近年來對(duì)RNA干擾和調(diào)節(jié)性小RNA的廣泛研究迫切需要一種能有效提取15?-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的試劑盒。但是傳統(tǒng)的RNA提取方法如硅膠膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。本試劑盒采用獨(dú)特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，強(qiáng)烈有機(jī)抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于離心柱內(nèi)特殊硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)進(jìn)一步去除， 最后低鹽的洗脫液將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國(guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2. 也不需要乙醇沉淀等容易喪失微小分子RNA的步驟。

3. 快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。

4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.9～2.0，基本無DNA殘留,可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各種實(shí)驗(yàn)。

 注意事項(xiàng)：

1. 第一次使用前請(qǐng)先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

2. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13，000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。

3. 需要自備乙醇，氯仿，一次性注射器，研缽。

4. Lysis/Binding buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 預(yù)防RNase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：

1) 經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase 污染。

2) 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3) RNA 在裂解液中時(shí)不會(huì)被RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液應(yīng)使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）

6. RNA 純度及濃度檢測(cè)：

完整性：RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳緩沖液；150v，15 分鐘)檢測(cè)完整性。由于細(xì)胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA 條帶。動(dòng)物rRNA 大小分別約為5 kb 和2kb，分別相當(dāng)于28S 和18S rRNA。動(dòng)物RNA 樣品中最大rRNA 亮度應(yīng)為次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴(yán)重降解。

純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數(shù)受測(cè)定所用溶液的pH 值影響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測(cè)出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260, OD280 測(cè)定，按照以下公式進(jìn)行RNA濃度的

計(jì)算：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。

操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

→ 提示：第一次使用前請(qǐng)先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution2/3瓶中加入指定量乙醇！

1. 組織培養(yǎng)細(xì)胞

a. 收集<10⁷懸浮細(xì)胞到一個(gè)1.5ml離心管。（對(duì)于貼壁細(xì)胞，孔板培養(yǎng)和細(xì)胞瓶培養(yǎng)可以直接裂解，盡可能吸干凈所有培養(yǎng)液殘留后直接加入1ml的Lysis/Binding buffer, 迅速輕搖使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有細(xì)胞接觸裂解細(xì)胞并滅活RNA酶，輕輕用移液槍反復(fù)吹打混勻接操作步驟項(xiàng)下3。）

b. 13，000rpm離心10秒（或者300g離心5分鐘），使細(xì)胞沉淀下來。完全吸棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)，注意不完全棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。

c. 輕彈管壁將細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加入1ml Lysis/Binding buffer，渦旋或者吹打，充分裂解混勻。

d. 接操作步驟項(xiàng)下3。

2. 動(dòng)物組織（例如鼠肝腦）

a. 新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,根據(jù)處理組織的質(zhì)量，按照50-100mg加入1ml的比例加入Lysis/Binding buffer后電動(dòng)或者手動(dòng)徹底勻漿。或者在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，取適量組織細(xì)粉（約50-100mg）轉(zhuǎn)入裝有1ml Lysis/Binding buffer的1.5ml離心管中,劇烈吹打渦旋混勻。

b. 可選,一般不需要：如果處理量大,有明顯顆粒或者不溶物,非常粘稠或者裂解不充分, 可立即用帶針頭的一次性 5 ml(約0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

c. 接操作步驟項(xiàng)下3。

3. 室溫放置5分鐘以充分分離核酸蛋白復(fù)合物。

4. 加入200μl 氯仿，劇烈振蕩15秒。

5. 室溫放置2-3分鐘，13，000rpm離心10分鐘。

6. 小心取上清（約600μl）轉(zhuǎn)入到新的離心管，加入1.5倍體積的無水乙醇（必須是室溫的，通常900μl），渦旋混勻。此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心，立刻接下步。

7. 將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm離心30-60秒，棄掉廢液。

8. 加700μl 700μl Wash Solution 1（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12，000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

9. 加入500μl Wash Solution 2/3（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl Wash Solution 2/3,重復(fù)一遍。

10. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

11. 取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

12. 如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30μg,加30-50μl RNase free water重復(fù)步驟11, 合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高, 分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15–30%, 但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇。

附：microRNA富集方法（僅僅提取microRNA，不包含>200 nt其它總RNA成份。）

1. 按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟1－5操作，直到得到上清。

2. 較精確估計(jì)上清體積（約600μl），加入等體積70％乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!）（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

3. 將混合物加入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm離心30-60秒，收集濾過物。將濾過物從收集管轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管后，把吸附柱子放回空的收集管內(nèi)，再加入剩下的混合物，離心，收集濾過物。合并兩次濾過物，計(jì)算體積。此時(shí)，濾過物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的總RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟8－11操作漂洗，洗脫回收得到去除了microRNA的總RNA。

4. 較精確估計(jì)濾過物體積，加入0.65倍體積無水乙醇（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

5. 取一套新的microRNA吸附柱MA，將上一步驟混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。

6. 按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟8－11操作漂洗，洗脫得到富集的microRNA。注意：不同的實(shí)驗(yàn)可以選擇不同的方法，例如Northern Blot或者表達(dá)芯片譜分析可以選擇提取包括microRNA的總RNA。富集方法提取的microRNA因?yàn)槿コ溯^大片段的mRNA和rRNA等，可能減少某些下游試驗(yàn)的擴(kuò)增背景，當(dāng)背景較高或者非特異擴(kuò)增較多時(shí)，可以嘗試使用富集方法提取的microRNA。