存儲 冰袋運(yùn)輸，-20℃存儲。有效期12個月。常溫狀態(tài)下可保存一周，2-8℃可以保存一個月。

產(chǎn)品簡介

膜蛋白與漿蛋白抽提試劑盒(Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡單、方便地從培養(yǎng)細(xì)胞或組織中抽提細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白的方法。抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜等上的膜蛋白,通過勻漿適度破碎細(xì)胞，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞核和少數(shù)未破碎的細(xì)胞產(chǎn)生的沉淀，隨后取上清高速離心獲得細(xì)胞膜沉淀和含有細(xì)胞漿蛋白的上清，然后通過優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑從沉淀中抽提獲取膜蛋白。

約90分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞或組織的細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性測定等后續(xù)實驗。不適合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受這些抑制劑影響的酶的活性測定。

操作步驟

注意：裂解蛋白的所有步驟都需在冰上或 4℃進(jìn)行。PMSF需要在抽提前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

使用說明：

1.準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的漿蛋白由提試劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。取適當(dāng)量的核蛋白抽提試劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 貼壁細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS洗一遍，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液處理細(xì)胞，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

3.懸浮細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS洗一遍，離心收集細(xì)胸、盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

3. 每20μl細(xì)胞沉淀加入200μl漿蛋白抽提試劑（使用前加入終濃度為1mM的PMSF）與1μL DTT。例如：對于二百萬Hela細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20μl或40mg。

5.最高速劇烈Vortex 5秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。（如果細(xì)胞沉淀沒有完全懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長vortex時間。)

6.冰浴10-15分鐘。

7.最高速劇烈Vortex5 秒，4℃ 12000-16000g離心5分鐘。

8. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存。（千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）

9.對于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50μl添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會帶來細(xì)胞漿蛋白的污染。）

10.最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。

11.4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。

12.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃凍存。

對于新鮮組織：

1.把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的漿蛋白抽提試劑（例如200ul漿蛋白抽提試劑中加入10ulDTT溶液）。并加入PMSF至最終濃度為1mM配制成組織勻漿液。每60mg組織加入200μl組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，冰浴或4℃進(jìn)行勻漿。

2.勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。

3. 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上清時千萬不要觸及沉淀。)

4.對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作，按照步驟4至步驟12抽提得到細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。

注意事項

1．裂解得到的蛋白樣品，由于含有較高濃度的去垢劑干擾，不能用 Bradford 法測定蛋白濃度，可以選用本公 司生產(chǎn)的 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

2．對于組織樣品，本試劑盒適用于新鮮組織，對凍存組織抽提效果較差。

3．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。