產品簡介

改進的異硫氰酸胍/酚一步法裂解細胞和滅活RNA 酶， 然后總RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟, 漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質去除， 最后低鹽的RNase free water將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。


產品特點

1.  離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

2.  結合了異硫氰酸胍/酚一步法試劑穩定性好，純度高和離心柱方便快捷的優點，不需要異丙醇沉淀和乙醇洗滌過程，RNA可以直接從離心柱上洗脫避免了過度干燥不易溶解問題。

3.  獨有的R裂解液配方，可以有效的消除基因組污染。

4.  多次漂洗去蛋白過程，提取RNA純度更高。

5.  有效的去除了5S在總RNA中含量，提高了純度。


注意事項

1. 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后請及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

2.  為防止RNA降解，所有離心步驟如未加說明，均在4℃低溫進行。使用轉速可以達到13，000 rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

3.  裂解液R中含有刺激性有害化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.  考慮到環保問題，本試劑盒不含有實驗室常用試劑氯仿，用戶使用前需要自備氯仿。

5.  常規的瓊脂糖凝膠電泳和變性膠電泳均可以用來分析RNA的質量。好的RNA產物在電泳后應該可以看到明顯的二條優勢核糖體RNA帶，分別為~5Kb（28S），~2Kb（18S），條帶亮度比值約為2：1。有時候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S，tRNA)帶。但有時候根據不同的物種如某些植物組織可以看到4，5條帶也屬于正常現象，如果RNA未成熟的前體或者不均一核RNA、小核RNA提取出來也可能看到介于7Kb和15Kb之間的不連續的高分子量條帶。

6.  檢測OD260/OD280吸光度比值時，RNA樣品應該溶于TE后檢測，如果用水稀釋后檢測，由于一般水離子強度和PH值低，會使OD280升高，從而使比值降低。

7.  加入裂解液R勻漿后，加氯仿前，樣品可在 –60℃-70℃ 保存一個月以上。

儲存和穩定性

1.  所有的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清。

2.  不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行。裂解液R可以常溫運輸，收到后4℃避光保存。

3.  避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

操作步驟

提示：第一次使用前請先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇! 

1.  勻漿處理

a.  組織：用玻璃或強力勻漿器攪勻組織樣品，保存于液氮內樣品需要用研缽磨碎，每50~100mg組織加1ml的細胞裂解液R后勻漿。組織樣品容積不能超過細胞裂解液R容積的10%。

b.  單層生長的細胞：直接往直徑3.5 cm的培養板中加入1ml的細胞裂解液R溶解細胞，并用移液槍輕輕吹打混勻。依據培養板的面積而不是依據細胞的數量來決定所需的細胞裂解液R量（每10cm2加1ml）。一般情況下，普通大小的細胞培養瓶，加入1ml的細胞裂解液R , 迅速輕搖使細胞裂解液R充分和瓶底所有細胞接觸裂解細胞并滅活RNA酶，輕輕用移液槍反復吹打混勻。當細胞裂解液R量不足時可導致抽提的RNA中污染有DNA。 

c.  懸浮生長的細胞：通過離心來沉淀細胞。在細胞裂解液R試劑中用移液槍反復吹打來裂解細胞。每5~10×106的動物細胞，植物或酵母菌細胞或每1×107細菌加1ml的細胞裂解液R。在加入細胞裂解液R前應避免洗滌細胞，否則會增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細菌可能需要使用勻漿器。

2.  將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15-30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。

3.  可選步驟：4°C的條件下12，000rpm 離心10分鐘，小心取上清轉入一個新的RNase free的離心管中。當樣品富含蛋白質、脂肪、多糖或是細胞外物質例如肌肉。脂肪組織或植物的塊莖部分時可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2~8°C的條件下以12,000rpm離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質，余下的沉淀中包含有細胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。

4.  每1ml細胞裂解液R 加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15秒并將其在室溫下孵育3分鐘。

5.  于4℃12，000rpm 離心10分鐘，樣品會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加細胞裂解液R體積的60%，把水相轉移到新管中，進行下一步操作。

建議：分層后細胞裂解液對RNA的保護作用減弱，因此操作上快些低溫更好。由正中插入液面下緩慢吸取大約460ul上相，避免擾動帶Rnase的中間層；一般吸取大約500ul上相即可，不必要盡可能多的吸取含RNA的水相。

6.  加入0.5倍體積無水乙醇，顛倒混勻（此時可能會出現沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起轉入吸附柱中（吸附柱套在收集管內）。

7.  12，000rpm 離心45秒，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。

8.  加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心45秒，棄掉廢液。

9.  加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 離心45秒，棄掉廢液。

10. 將吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

11. 取出吸附柱，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加50-80μl  RNase free water， 室溫放置2分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要RNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積最好不少于30μl，體積過小降低RNA洗脫效率，減少RNA產量。

12.  電泳推薦方案：用3mm×1mm小梳子，初始量為5ul電泳。電泳電壓4-10v/cm，電泳時間20-25分鐘。