貨號 PH0200
名稱 質(zhì)粒小量提取試劑盒（Plasmid Mini Preparation Kit）
規(guī)格 50T | 100T
存儲 室溫保存，一年有效。

產(chǎn)品組分
試劑盒組成 50T 100T 儲存條件
RNase A 300ul 500ul -20℃
溶液Ⅰ 15ml 30ml RT
溶液Ⅱ 15ml 30ml RT
溶液Ⅲ 20ml 40ml RT
漂洗液 15ml 15ml×2 RT
洗脫液 15ml 30ml RT
吸附柱 50個 100個 RT
收集管 50個 100個 RT
說明書 1份 1份 RT


產(chǎn)品簡介

本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。 使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。


使用步驟

1、取1-5ml細菌培養(yǎng)物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。
*注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

3、向離心管中加入250ul溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。

4、向離心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。

9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

10、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

注意事項

1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)， pH值低于7. 0會降低洗脫效率， DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10ml過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當?shù)难娱L時間，以增加提取效率。

4. DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。 得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。 DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA、 40ug/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。