產品說明：

試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質粒 DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質粒 DNA 的產量。吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附 DNA，可最大限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質粒 DNA 可適用于各種常規(guī)的分子生物學實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。

注意：使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽（50T/100T 的漂洗液Ⅰ每瓶需要單獨加入 16mL/32mL 的無水乙醇，漂洗液Ⅱ每瓶需要單獨加入 45mL 的無水乙醇）。YP1 在使用前先加入 RNase A（將試劑盒中提供的 RNase A 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

操作步驟：

1. 取 1-5mL 酵母培養(yǎng)物（不超過 5×10⁷cells），12000rpm 離心 1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

2. 酵母細胞壁的破除：

A、酶法：向酵母菌體中加入 470μL 山梨醇 Buffer，充分懸浮菌體，加入 25μL 酵母破壁酶和 5μL 巰基還原劑，充分混勻，30℃處理 1-2h，期間可顛倒離心管混勻數次。12000rpm 離心1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入 250μL P1（請先檢查是否已加入 RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。

B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入 250μL P1（請先檢查是否已加入 RNaseA），充分懸浮沉淀。加入 150-200μL 酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩 10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請用 P 1 補足至 250μL）于另一干凈離心管中。

3. 向離心管中加入 250μL P2，溫和地上下翻轉 6-8 次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染酵母基因組 DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過 5 min，以免質粒受到破壞。

4. 向離心管中加入 350μL P3，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm 離心 20 min，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：P3 加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 取上一步上清，加入 0.4 倍體積無水乙醇，充分混勻。（體積過多可分兩次混合，然后上柱）

6. 將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8. 向吸附柱中加入 600μL 漂洗液ⅠⅠ(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm 離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

9. 重復操作步驟 8。

10. 12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR 等。

11. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50-200μL 經 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min。

12. (可選)為了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min。

注意事項：

1、使用前請先檢查 P2 和 P3 是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。

2、洗脫緩沖液體積不應少于 50μL，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調至此范圍)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率；DNA 產物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。

3、質粒得率與酵母菌株、質粒拷貝數、培養(yǎng)條件等因素有關。通常酵母質粒拷貝數都很低，一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到，可通過 PCR 或轉化大腸桿菌來檢測。

4、DNA 濃度及純度檢測：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應在 OD260 處有顯著吸收峰， OD260 值為 1 相當于大約 50 μg/mL 雙鏈 DNA、40 μg/mL 單鏈 DNA。OD260/OD280 比值應為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為 pH 值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。